熒光顯微鏡，也就是這么回事

　　在諸多顯微鏡的觀察模式中，明場(chǎng)成像得到的是光強(qiáng)度zui直接的變化，相差成像等技術(shù)也大多是將光的相位差等轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)度差，使人眼能夠感受到。熒光成像技術(shù)則是特異性地區(qū)分出光的波長(zhǎng)，也就是光的顏色，使人眼能夠區(qū)分。

　　光被人眼所看到分為兩種形式：發(fā)光和反光。明場(chǎng)成像屬于反光形式，熒光則屬于發(fā)光形式。

　　物體獲得能量后可能產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，能量來源可能是熱能（如白熾燈），化學(xué)能（如螢光）或者核能（如陽光），而熒光的能量來源則是另一束能量更高的光。

　　高能量的光子與電子碰撞，使得電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的電子很不穩(wěn)定，會(huì)重新回落到基態(tài)，這個(gè)過程中會(huì)消耗部分熱能，并發(fā)出新的光子。新的光子能量比zui初的光子能量低，因此波長(zhǎng)更長(zhǎng)。由于新的光子波長(zhǎng)區(qū)別于入射光的光子波長(zhǎng)，通過一定的光學(xué)處理方法將兩束不同波長(zhǎng)的光分開，從而使我們只看到發(fā)射出來的新光子（熒光信號(hào)），也就是熒光顯微鏡看到的熒光圖像。

　　具有熒光特性的物質(zhì)叫熒光素，不同的熒光素對(duì)不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)效率不同，這種差異體現(xiàn)在熒光素的激發(fā)光譜上。同樣的，不同熒光素發(fā)射出的新光子波長(zhǎng)也不同，這種差異體現(xiàn)在熒光素的發(fā)射光譜上。因此，了解一種熒光素的實(shí)驗(yàn)方法，主要是了解其激發(fā)和發(fā)射光譜，其中發(fā)射光譜是熒光素的特征光譜。

　　實(shí)現(xiàn)入射光與發(fā)射光分離的部分是熒光顯微鏡的核心，通常采用三片濾光片結(jié)構(gòu)。

　　以白光作為激發(fā)光源時(shí)，利用*塊激發(fā)光濾光片將白光過濾，使熒光素對(duì)應(yīng)的zui適激發(fā)波長(zhǎng)的光透過。二向色鏡是這個(gè)結(jié)構(gòu)的核心，它負(fù)責(zé)將入射光與發(fā)射熒光分開，使入射光反射進(jìn)入物鏡，照射到樣本上，樣本中的熒光素便被激發(fā)產(chǎn)生熒光，發(fā)射出來的熒光被物鏡收集后，穿過二向色鏡。熒光再通過發(fā)射光濾光片，選擇具有特征性的發(fā)射光范圍，zui終進(jìn)入目鏡或者成像設(shè)備中。

　　以上的結(jié)構(gòu)是常見的熒光顯微鏡成像光路，也被稱作反射熒光光路。

　　熒光照明的光源有很多種，理論上普通的白光光源也可以，但是實(shí)際上因?yàn)闊晒獾募ぐl(fā)效率很低，因此需要亮度足夠的光源。目前常用的熒光光源有4種：

　　汞燈：汞蒸氣激發(fā)光源，傳統(tǒng)熒光光源。

　　氙燈：氙弧光燈，光譜連續(xù)且強(qiáng)度平均。

　　激光：?jiǎn)紊院?，?qiáng)度高。

　　LED：壽命長(zhǎng)，單色性較好，亮度高，是今后光源的主要發(fā)展方向。

　　熒光成像的優(yōu)勢(shì)：

　　通過二向色鏡將入射光和熒光區(qū)分開，使我們只看到熒光信號(hào)，沒有其他光線的干擾，因此可以看到很微弱的信號(hào)，比如單分子熒光。

　　因?yàn)闊晒馑乜梢蕴禺愋缘貥?biāo)記到不同的細(xì)胞或分子上，因此可以區(qū)分不同的細(xì)胞或分子。

　　不同強(qiáng)度的熒光可以進(jìn)行比較，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞或分子的定量分析。

　　目前更的顯微鏡系統(tǒng)，如共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、超高分辨率顯微鏡、光切片顯微鏡等都是利用熒光成像方法進(jìn)行觀察和分析的。